1. 크로마토그래피의 기초
: 예비 분리와 분석 분리로 구분 가능
1) 분석 분리의 기초
(1) 증류에 의한 분리
: 휘발성인 분석물을 비휘발성인 방해물질로부터 분리
: 완전 분리, 부분 분리
(2) 추출에 의한 분리
: 밀도가 상당히 다르면서 혼합되지 않는 두 액체의 분배 평형에 기초
: 분배 계수 (K) = [S]2/[S]1
: n회 추출에서 상 1에 남는 분율 = q^n = (V1 / V1 + KV2)^n (일반적)
ㄱ) 추출의 pH 영향
: 분포 계수 (D) = 상 2의 전체 농도 / 상 1의 전체 농도
: 분포 계수 (D) = 분배 계수 (K) x α_HA
: 분배 계수 K 대신 분포 계수 D를 사용할 경우는 B와 BH+와 같이 두 개 이상의 화학종을 가지는 용질을 다룰 때임
ㄴ) 금속 킬레이트제에 의한 추출
: 금속 이온 추출에서 분포 계수 (D)는 pH와 리간드 농도에 의존
(3) 크로마토그래피
ㄱ) 관 크로마토그래피
: 용매에 대한 친화도 차이 이용
a) 정지상과 이동상
: 정지상은 움직이지 않는 부분
: 이동상은 혼합물을 녹여서 흐르는 부분
: 고정상과의 인력이 약하고 이동상과의 인력이 클수록 이동 속도가 빠름
ㄴ) 종이 크로마토그래피
a) R_f 값
: 물질의 특성
: R_f = 성분 물질이 이동한 거리 / 이동상이 이동한 거리
b) 종이 크로마토그래피에서 유의할 점
ㄷ) 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)
2) 크로마토그래피의 기본 원리
: 용매 추출과 같은 원리
: 상 하나는 고정, 다른 상이 그 위를 지나감
: 이동성은 액체이거나 기체
: 정지상은 고체입자 표면에 덮여진 점도가 있는 액체
: 용리액은 칼럼으로 들어가는 액체
: 용출액은 칼럼에서 나오는 액체
: 용리는 크로마토그래피의 칼럼을 통해 액체나 기체가 통과하는 과정
(1) 크로마토그램
(2) 칼럼 성능을 향상시키는 방법
: 띠분리 증가
: 띠 나비 감소
(3) 구체적인 크로마토그래피 분리 모양
ㄱ) 머무름 시간 (tr)
: 혼합물이 컬럼에 주입된 후에 각 성분이 검출기까지 도달하는데 걸리는 시간
ㄴ) 불감 시간 (틈새시간, tm)
: 정지상에 머무르지 않는 이동상의 최소의 시간
ㄷ) 보정 머무름 시간 (tr’)
: 칼럼의 길이를 통과하는데 걸리는 추가적인 시간
: tr’ = tr - tm
ㄹ) 머무름 인자 (용량 인자, k)
: k = (tr - tm) / tm = tr’ / tm
ㅁ) 보정 없는 상대 머무름 (γ)
: γ = 성분 2의 머무름 시간 / 성분 1의 머무름 시간 = 성분 1의 속도 / 성분 2의 속도
ㅂ) 상대 머무름 (α)
: α = tr2’ / tr1’
: α > 1
: 상대 머무름이 클수록 분리 잘 됨
(4) 머무름 시간과 분배계수 사이의 관계
: k = 용질이 정지상에서 보낸 시간 / 용질이 이동상에서 보낸 시간 = 정지상에 있는 용질의 몰수 / 이동상에 있는 용질의 몰수 = CsVs / CmVm
: k = KVs / Vm
: 분배계수 K = Cs / Cm
: α = tr2’ / tr1’ = k2 / k1 = K2 / K1
(5) 분리효율
: 봉우리 사이의 용리시간의 차이
: 봉우리가 얼마나 넓게 퍼져 있는가
ㄱ) 분리도
: 분리도 (R) = 용매가 칼럼을 통과하는 데 걸린 시간 / 용질이 칼럼을 통과하는 데 걸린 시간 = tm / tr
: R = △tr / w_av = △Vr / w_av
(w = 두 봉우리의 평균 나비)
△tr 또는 △Vr은 봉우리 사이의 분리(시간 또는 부피 단위)
: 정량 분석을 위해 분리도 (R) > 1.50는 되어야 함
(6) 확산
ㄱ) 단높이 : 칼럼 효율의 측정 (H)
: H = L / N = σ^(2) / x
L = 칼럼 전체 길이
N = 이론 단수
X = 띠의 흐름 중심으로부터 칼럼 길이에 따라 퍼져 나간 것
: 띠의 표준편차 σ = (2Dt)^(1/2)
ㄴ) 이론 단수 (N)
: N = L / H = Lx / σ^2 = L^2 / σ^2 = 16L^2 / w^2
: N = 16(t_r)^2 / w^2 = (t_r)^2 / σ^2
ㄷ) 분리도에 영향을 미치는 인자
: N^(1/2) (γ - 1) / 4
: 분리도가 (N)^(1/2)에 비례
(7) 단높이 식
: H = A + B/(u_x) + C(u_x)
ㄱ) 세로 확산
: B/(u_x)와 관련
ㄴ) 상 사이에서의 일정 평형시간 (질량이동 항)
: 용질이 이동상과 정지상 사이에서 평형을 이루는 데 소요되는 일정한 시간 때문에 생김
: 정지상의 두께 감소 → 확산되어 나오고 들어가는 소요 시간 감소 → 단높이 감소
: C(u_x)와 관련
ㄷ) 다통로 (소용돌이 확산)
: 이론이 분명하지 않은 여러 복합적인 영향 때문에 생김
: A와 관련
: 열린관 칼럼에서는 고려할 필요 없음
ㄹ) 열린관 칼럼의 장점 ; 기체 크로마토그래피
: 기체 크로마토그래피에서 열린관 칼럼이나 충전 칼럼을 선택
: 열린관 칼럼은 충전 칼럼에 비해 분리도 높음, 적은 양의 분석물질에도 감도 증대
: 정제용 분리에는 부적합
(8) 비대칭 띠 모양
: 과주입 → 앞세우기
: 적은 양이 정지상에 강하게 머무를 때 → 꼬리 끌기
2. 크로마토그래피의 종류
1) 기체 크로마토그래피
(1) 기체 크로마토그래피 종류
ㄱ) 기체-고체 크로마토그래피
ㄴ) 기체-액체 크로마토그래피 (일반적으로 기체 크로마토그래피 ; GC라고 부름)
(2) 기체 크로마토그래피에서의 분리과정
: GC 구성 장치
ㄱ) 열린관 칼럼
a) 열린관 칼럼의 종류
: WCOT (내벽-코팅)
: SCOT (지지체-코팅)
: PLOT (고체 정지상-코팅)
b) 열린관 칼럼할 때 분리도를 높이기 위한 방법
: 좁은 칼럼
: 긴 칼럼
: 두꺼운 정지상 ; 정지상 두께 증가 → 머무름 시간 증가 → 일찍 용리되는 봉우리의 분리도 증가
: 충전칼럼에 비해 분석시간이 짧음
: 충전칼럼에 비해 감도가 증가
: 충전칼럼에 비해 적은 시료용량으로도 분석 가능
ㄴ) 충전칼럼
: 비휘발성인 액체 정지상이 입혀진 미세한 고체 지지체로 채워짐 or 정지상이 될 수 있는 지지체 자체로 채워짐
: 분리도가 다소 떨어짐
: 제조용 분리나 머무름이 약한 기체를 분리할 때 유용
a) 고체 지지체
b) 지지체의 입자 크기와 분리도의 관계
: 입자 크기 감소 → 용질이 평형에 도달하는 데 필요한 시간 감소 → 칼럼 효율 증가
: 입자 크기 감소 → 더 높은 압력 필요
ㄷ) 머무름 지수 (I)
ㄹ) 칼럼 오븐, 온도와 압력 프로그래밍
: 최적의 분리는 낮은 온도에서 이루어짐
: 낮은 온도에서는 용리시간이 길어짐 → 분석을 완성하는 시간 증가 → 50~250°C 범위에서 매분 8°C씩 증가시킴
ㅁ) 운반 기체
: 헬륨이 가장 흔히 사용됨
: 불꽃 이온화 검출기 ; N2가 더 낮은 검출 한계 제공
: 최적 흐름 속도, 확산 계수 ; N2 < He < H2
: 질량분석 검출기 ; H2 사용하지 않음 ; H2가 검출기 안에 있는 진공펌프 오일을 손상시킴
ㅂ) 보호 칼럼과 머무름 간격
a) 보호 칼럼
: 칼럼 성능 낮추는 비휘발성 물질 모으기 위함
b) 머무름 간격
: 봉우리의 모양을 개선하기 위함
ㅅ) 시료 주입
a) 분할 주입
: 관심대상의 분석물질이 시료의 0.1% 미만인 경우
b) 비분할 주입
: 시료의 0.01% 이하가 되는 분석물질을 분석하는 흔적량 분석에 이용
: 비분할 주입을 위한 주입기 온도는 분할주입 때보다 낮음
c) 용매 트래핑
: 초기 칼럼 온도는 용매의 끓는점보다 40도 낮게 설정 → 용매는 칼럼 앞부분에서 응축 → 칼럼 앞부분에서 좁은 띠 형성
d) 냉각 트래핑
: 초기 칼럼 온도는 용질의 끓는점보다 150도 낮게 설정 → 용매와 끓는점이 낮은 성분 빨리 용출, 끓는점이 높은 용질은 좁은 띠에 머무름 → 칼럼 온도를 빨리 높여 끓는점이 높은 용질이 나오게 함 → 칼럼 앞부분에서 용질의 좁은 응축 띠 형성
e) 칼럼-위 주입
: 시료의 끓는점 이상에서 분해되는 시료 분석 시
: 정량분석을 위해 분할 혹은 비분할 주입보다 온도가 낮음
: 용액은 뜨거운 주입기 통하지 않고 직접 칼럼에 주입
(3) 기체 크로마토그래피 검출기의 이상적인 특성
: 검출기 종류
ㄱ) 열 전도도 검출기
: 모든 분석물질에 감응
: 작은 열린관 칼럼으로부터 나오는 분석 물질의 적은 양을 검출하기에는 감도 불충분
: 충전칼럼에는 지금도 사용
: 감도는 흐름속도에 반비례
: 모든 용질이 기체 상태로 존재할 수 있는 범위에서 가장 낮은 온도 유지해야 함
ㄴ) 불꽃 이온화 검출기
: 이온 형성은 불꽃 속에 들어온 탄소원자의 수에 비례
: 열린관과 충전칼럼 기체 크로마토그래피에 흔히 사용
: 비탄화수소에는 감도 없음
ㄷ) 그 밖의 검출기
a) 전자 포획 검출기
: 할로젠을 함유하고 있는 분자
b) 질소-인 검출기
: 질소와 인을 함유하는 화합물에 예민
: 탄화수소에 감응하지 않음
c) 불꽃 광도 검출기
: 인, 황, 납, 주석 또는 다른 선택된 원소들로주터 광학 발광 측정
d) 광이온화 검출기
e) 황 화학발광 검출기
f) 질소 화학발광 검출기
g) 원자 방출 검출기
2) 액체 크로마토그래피
(1) 액체 크로마토그래피의 종류
ㄱ) 흡착 크로마토그래피
: 정상 크로마토그래피 ; 극성인 정지상과 극성이 적은 용매
: 역상 크로마토그래피 ; 정지상이 비극성이거나 약한 극성이고, 용매가 조금 더 극성
: 역상 크로마토그래피 이용 시 봉우리 꼬리 끌기 현상 제거 가능
ㄴ) 분배 크로마토그래피
ㄷ) 이온 교환 크로마토그래피
ㄹ) 분자 배제 크로마토그래피
(2) 충전칼럼의 이용
: 정지상과 이동상 사이의 질량 이동 속도를 증가시켜야 기체 크로마토그래피 효율 증대
: 액체의 확산속도는 기체 확산속도보다 약 100배 느림
: 액체 크로마토그래피는 충전칼럼 사용
: 작은 입자가 더 좋은 분리도를 보이는 이유 ; A항 감소, C항 감소 but 용매흐름에 대한 저항 존재
(3) 이동상 저장 용기와 용매 처리 장치
ㄱ) 펌프 장치
ㄴ) 시료 주입 장치
ㄷ) HPLC 칼럼
a) 정지상
b) 보호 칼럼
: 주 칼럼과 같은 정지상으로 충전됨
(4) 용리과정
: 용리액 세기 증가 → 용질은 칼럼으로부터 더욱 빨리 용리
ㄱ) 등용매 용리와 기울기 용리
: 등용매 용리 ; 한 가지 용매로 수행
: 기울기 용매 ; 한 용매가 모든 성분을 적당한 빠르기의 속도로 용리시키지 못하는 경우, 넓은 조성 범위가 요구된 경우
a) 등용매 용리 과정과 기울기 용리 조건의 선택의 예
: 시료는 이동상보다 용리액 세기가 작은 용매에 녹이거나 이동상에 녹이는 것이 좋음
: 검출기 종류
(5) 분광광도 검출기
(6) 자외선 검출기
: 용매의 흡수가 강하면 사용 불가
(7) 형광 검출기
: 레이저 이용
: 감도 좋음
: 형광을 발생시킬 수 있는 소수의 분석물질에만 적용 가능
(8) 굴절률 검출기
: 기울기 용리에는 사용되지 않음
(9) 증발 광-산란 검출기
: 이동상보다 휘발성이 상당히 낮은 어떤 분석물질에 대해서도 감응
: 감응정도는 분석물질의 양과 관련
: 감응이 비선형적
: 기울기 용리에 적용
: 용리액으로 완충용액 사용시 반드시 휘발성이 있어야 함
(10) 전기화학 검출기
: 흐름 속도와 온도 변화에 아주 민감
3) 그 밖의 크로마토그래피
(1) 이온-교환 크로마토그래피
: 머무름은 용질이온과 정지상에 결합된 하전된 자리 사이의 인력에 근거를 둠
ㄱ) 음이온 교환체
: 정지상에 붙어있는 양으로 하전된 기
ㄴ) 양이온 교환체
: 공유결합으로 붙은 음으로 하전된 자리
ㄷ) 이온-교환 선택성
: 이온교환 수지는 전하가 클수록, 수화반경이 감소할수록, 분극성이 큰 이온에 대해 더 큰 친화성을 보임
ㄹ) Donnan 평형
: 용액 내의 이온과 수지 내 이온 사이의 평형
: 수지의 이온형과 같은 전하의 이온은 배제됨
(2) 이온 크로마토그래피 ; 이온 교환 크로마토그래피 업그레이드 버전
ㄱ) 억압-이온 음이온과 양이온 크로마토그래피
: 억압-이온 크로마토그래피에서는 전도도 측정에 앞서 원하지 않는 전해질을 제거
: 용리액의 농도 기울기법이 억압에 사용될 수 있음
(3) 이온쌍 크로마토그래피
: 용리메커니즘은 역상과 이온 교환 결합이 동시에 관여
(4) 분자배제 크로마토그래피
: 분자가 그들의 크기에 따라 분리됨
: 작은 분자는 정지상의 작은 구멍 속으로 침투 가능 ; 정지상에 다공성 막 존재
: 큰 분자들이 먼저 용출 ; 정지상의 다공성 막에 침투 불가 → 그냥 흘러가는 느낌
: 겔 거르기는 분자량이 상당히 다른 분자들의 혼합물을 분리하는 데 이용
: 분자량은 같으나 모양이 다른 분자들이 서로 다른 용리 특성을 보이니, 분자량 해석 시 유의
(5) 모세관 전기이동
: 전기이동 ; 전기장의 영향 하에서 용액 중 이온의 이동
: 이상 조건 하에서 넓힘에 의한 근본적인 원인은 세로확산 (H = B/(u_x))
ㄱ) 전기이동
: u_ep = qE / f = (μ_ep)E
(f = 마찰 계수, μ_ep = 전기이동 이동도)
: 작은 분자의 경우 이동도의 크기는 전하가 증가할수록 커짐
: 반경이 증가할수록 이동도는 낮아짐
ㄴ) 전기삼투
: u_eo = (μ_eo)E
: 전기삼투 이동도는 실리카의 표면전하 밀도에 비례, 이온세기의 제곱근에 반비례
ㄷ) 실제 이동도
: μ_app = μ_ep + μ_eo
: 전기이동 ; 양이온의 경우 μ_ep와 μ_eo의 부호 동일, 음이온의 경우 μ_ep와 μ_eo의 부호 반대
: 전기삼투는 공통적으로 음극 쪽으로 향함
ㄹ) 분리방식
: 모세관 벽이 음전하면 전기삼투 흐름은 음극 쪽, 용출 순서는 양이온 > 중성 > 음이온
: 모세관 벽에 양이온 계면 활성제 입힌 경우 기가 극성 반대 (전기삼투 흐름은 양극 쪽) → 용출 순서는 음이온 > 중성 > 양이온
ㅁ) 실제 이동도와 전기삼투 이동도의 계산식
: μ_app = (u_net) / E = (Ld x Lt) / (V x t)
(Ld = 주입구로부터 검출기까지의 칼럼 길이, Lt는 끝에서 끝까지의 칼럼 길이, V = 두 끝 사이에 걸어준 전압, t = 주입구 끝에서부터 검출기까지 이동하는 데 걸리는 시간)
: 시료에 자외선을 흡수하는 중성 용질을 첨가하여 검출기로 이동시간(t_중성)을 재서 시간 측정
ㅂ) 전기이동법의 정량 분석
: 정규화된 봉우리 면적 = 봉우리 면적 / 이동 시간
(6) 진화 크로마토그래피
: 복잡한 화합물로부터 단일 화합물을 분리할 때
(7) 키랄 크로마토그래피
: 서로 겹쳐 놓을 수 없는 거울상 화합물들을 분리할 때
(8) 초임계 유체 크로마토그래피
: 기체 및 액체 크로마토그래피를 혼성시킨 방법
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